Bartonella quintana に対するコロモジラミとアタマジラミの異なるベクター能力におけるディフェンシンの潜在的役割の探索

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 183 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

ヒトのコロモジラミとアタマジラミは同種ですが、コロモジラミのみがバルトネラ・キンタナなどの細菌性病原体を媒介する媒介者として機能します。 どちらのシラミ亜種も、ディフェンシン 1 とディフェンシン 2 という 2 つの抗菌ペプチドしか持っていません。したがって、これら 2 つのシラミ亜種の分子的および機能的特性の違いが、それらの間のベクター能力の違いの原因である可能性があります。

ベクター能力の分子基盤を解明するために、我々は、ハジラミとアタマジラミにおける 2 つのディフェンシンの構造特性と転写因子/マイクロ RNA 結合部位の違いを比較しました。 抗菌活性スペクトルも、バキュロウイルスを介して発現させた組換えシラミディフェンシンを使用して調査されました。

ディフェンシン 1 の全長アミノ酸配列は両亜種で同一でしたが、ディフェンシン 2 の 2 つのアミノ酸残基は 2 つの亜種間で異なっていました。 組換えシラミディフェンシンは、代表的なグラム陽性黄色ブドウ球菌に対してのみ抗菌活性を示し、グラム陰性大腸菌や酵母カンジダ・アルビカンスのいずれに対しても抗菌活性を示さなかった。 しかし、それらはB. quintanaに対してかなりの活性を示し、コロモジラミのディフェンシン2はアタマジラミのディフェンシン2よりも効力が大幅に弱かった。制御配列分析により、コロモジラミのディフェンシン1とディフェンシン2の両方の遺伝子ユニットの転写数が減少していることが明らかになった。因子結合部位は減少したが、マイクロRNA結合部位の数は増加しており、ハジラミディフェンシンの転写活性が比較的低いことを示唆している。

ディフェンシン 2 の抗菌活性が大幅に低いことと、コロモジラミにおけるディフェンシン発現の可能性の低下は、B. quintana の増殖と生存率に対する免疫反応の緩和に寄与している可能性が高く、その結果、アタマジラミと比較してコロモジラミの媒介能力が高くなります。

人体のシラミ Pediculus humanus humanus とアタマジラミ P. h. capitis は、その一生を人間の宿主上で過ごし、人間の血液を食べる吸血性の外部寄生虫です。 ヒトのアタマジラミの蔓延は経済的および社会的問題を引き起こす一方、ヒトのコロモジラミの蔓延は細菌性疾患を媒介することで公衆衛生を脅かします[1]。 コロモジラミは、人類が衣服を着始めた 4 万年から 7 万年前に同種のアタマジラミから進化したと考えられており [2]、アタマジラミよりも高い媒介能力を持っています。 これら 2 種類のシラミのうち、コロモジラミのみが、それぞれ海溝熱、流行性発疹チフス、回帰熱を引き起こすバルトネラ・キンタナ、リケッチア・プロワゼキ、ボレリア・レカレレンティスなどのグラム陰性細菌病原体を媒介することが知られています。 しかし、アタマジラミがヒトに細菌性疾患を伝染させることは知られておらず、これはおそらくコロモジラミに対するものと比較してより高い免疫反応のためである[3、4、5]。

コロモジラミとアタマジラミの両方における代表的な免疫関連遺伝子のゲノムワイド分析により、93 個の遺伝子の共通セットが明らかになり、他の昆虫と比較してヒトシラミの免疫系が著しく低下していることが示されました [3]。 体液性免疫系に関連する遺伝子の数はヒトシラミでは大幅に減少しており、一部の免疫遺伝子はヒトシラミのゲノムに存在しません [3、6]。 ヒトシラミのこの簡素化された免疫システムは、シラミが人間の血液のみを食べる寄生生活環によるものであると示唆されており、血液は比較的無菌の食事であると考えられています。 興味深いことに、ヒトのコロモジラミとアタマジラミの両方のゲノムで同定されている抗菌ペプチド (AMP) は、ディフェンシン 1 とディフェンシン 2 の 2 つだけです [3]。 比較トランスクリプトーム解析により、コロモジラミとアタマジラミの両方が事実上同じ遺伝的背景を持っていることが明らかになり[7]、これら 2 種類のシラミ間の媒介能力の明らかな違いは、免疫関連遺伝子の転写プロファイルの違いによるものである可能性が示唆されています。ディフェンシン。 ディフェンシン 1 とディフェンシン 2 の両方の基礎転写レベルは、コロモジラミの消化管組織よりもアタマジラミの消化管組織で有意に高いことが判明しました [4]。 さらに、B. quintana による経口攻撃の後、ディフェンシン 1 の発現はアタマジラミの消化管組織で誘導される可能性がありますが、コロモジラミでは誘導されません [5]。 総合すると、これらの発見は、ディフェンシン 1 および 2 の構成的および誘導的発現によって媒介される免疫応答の増強がアタマジラミの媒介能力の低下に寄与していることを示唆しています。

ヒトシラミの免疫応答および媒介能力におけるシラミディフェンシンの重要性にもかかわらず、これらのAMPの構造的特性および機能に関する詳細な情報は少ない。 ディフェンシンの発現がどのように異なって調節されているのか、また体シラミとアタマジラミの間でディフェンシンの抗菌活性に違いがあるのか​​どうかは、まだ解明されていない。 さらに、B. quintana などの病原性細菌に対するシラミ ディフェンシンの有効性はまだ判明していません。

この研究では、シラミディフェンシンの分子的および機能的特性を特徴付けました。 シラミディフェンシンの潜在的な転写因子結合部位とマイクロRNA（miRNA）結合部位をコロモジラミとアタマジラミの間で比較し、それらの亜種間の差次的発現プロファイルを解明した。 in vitro で発現させた組換えディフェンシン 1 およびディフェンシン 2 を使用して、シラミ ディフェンシンの抗菌活性スペクトルを測定し、コロモジラミとアタマジラミの間で比較しました。 この研究で提示されたデータは、ディフェンシン 1 および 2 によって媒介されるコロモジラミとアタマジラミ間の媒介能力の違いについての深い理解を促進するはずです。

コロモジラミのサンフランシスコ株とアタマジラミの南フロリダ株は、30 °C、相対湿度 70 ～ 80%、明暗 16/8 時間の制御された条件下で、体外膜給餌システム [8] で飼育されました。飼育チャンバー内（治験審査委員会番号 E2211/001–003）。

コロモジラミおよびアタマジラミのディフェンシン相補 DNA (cDNA) 配列は、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) および以前の出版物 [6] から入手し、次の方法で確認されました。コロモジラミのサンフランシスコ株とアタマジラミの南フロリダ株からの cDNA のクローニングと再配列。 38 種の昆虫のディフェンシンのアミノ酸配列を、CLC Main Workbench 8 分析パッケージ (CLC Bio、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用してアラインメントしました。 系統樹は、MEGA X (ペンシルベニア州立大学、ユニバーシティパーク、ペンシルベニア州、米国) を使用し、1000 回のブートストラップ複製によるジョーンズ-テイラー-ソーントン (JTT) モデルに基づく最尤法を使用して構築されました。 ツリーの各ノードの数字は、1000 個の擬似レプリケートに基づくブートストラップ値のパーセンテージを示します。 ディフェンシンの三次元 (3D) 構造モデリングは、タンパク質データ バンク内の昆虫ディフェンシン A [9] およびハマダラカ ディフェンシン [10] ペプチドの構造に基づいて実行されました。 シラミ遺伝子の配列は、構造予測のために SWISS-MODEL (Automated Comparative Protein Modeling Server) [11] の分子モデリング サーバーに送信され、UCSF Chimera プログラム [12] を使用して 3D 構造が分析されました。 シグナルペプチドの切断部位、疎水性、分子量、等電点 (pI)、および pH 7 での正味電荷は、SignalP 6.0 サーバー (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP) を使用して予測されました。 13]、ProtScale ツール (https://web.expasy.org/protscale/) [14]、Compute pI/MW ツール (https://web.expasy.org/compute_pi/) [14]、およびペプチド特性計算ツール ( https://pepcalc.com/) をそれぞれ参照してください。 遺伝子の 5' 上流領域の転写因子結合部位は、モチーフ発見プログラム PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/) を使用して予測されました。 標的遺伝子の 1000 bp の推定制御領域 (転写開始部位からの上流 800 bp と下流 200 bp のゲノム DNA 配列) を、転写因子結合部位の予測に使用しました。 配列は、ベクターベース (http://www.vectorbase.org) と、アタマジラミとアタマジラミのそれぞれのアタマジラミのゲノム配列データ [6] から取得されました。 ボディおよびアタマジラミからのディフェンシン 1 および 2 転写産物の 3' 非翻訳領域 (UTR) は、miRNA 配列データベース miRBase (http://mirbase.org) [15] を使用した miRNA 予測に使用されました。 E 値のカットオフは 10 で、特定の予測には節足動物 miRNA 配列データベースが使用されました。

製造者の指示に従って、200 μl の TRI 試薬 (米国オハイオ州シンシナティの分子研究センター) を使用して、5 匹の胴シラミとアタマジラミからの全 RNA を抽出しました。 全 RNA から DNA 汚染を除去するために、DNase I (タカラバイオ、京都、日本) で処理し、SuperScript IV 逆転写酵素 (Invitrogen、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) とオリゴ dT プライマーを使用して cDNA を合成しました。 コロモジラミのディフェンシン 1 および 2、およびアタマジラミのディフェンシン 2 のシグナルペプチドおよび成熟ペプチド領域を、遺伝子特異的プライマー (追加ファイル 1: 表 S1) と Advantage Taq (Clontech、カリフォルニア州パロアルト、アメリカ合衆国）。 次いで、これらを、６×Ｈｉｓタグを含む相補的な一本鎖プライマーを用いてｐＢａｃＰＡＫ８ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に一緒に挿入した。 各クローニングステップのプラスミド配列は、DNA 配列決定 (Macrogen、ソウル、韓国) によって検証されました。 ディフェンシンを含むトランスファーベクターを、10% ウシ胎児血清 (WelGENE) を添加した TC-100 培地 (WelGENE、慶山、韓国) で 27 ℃で培養した Sf9 細胞 (Invitrogen、Thermo Fisher Scientific) に BacPAK6 DNA (Clontech) と同時トランスフェクトしました。 C (追加ファイル 2: 表 S2)。 Bacfectin 試薬 (Clontech) によるトランスフェクションの 5 日後、感染細胞から上清を収集し、ウイルスストックとして使用しました。 最初のウイルスストックを 5 × 106 Sf9 細胞に播種し、感染 3 日後に 3300 rpm、4 °C で 15 分間の遠心分離により上清を収集しました。 Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit-3 kDa (MilliporeSigma、バーリントン、マサチューセッツ州、米国) を使用し、7500 × g で 40 分間、4 °C で遠心分離することにより、上清を濃縮しました。 濃縮した上清を 5 ml HisTrap HP アフィニティ カラム (GE Healthcare、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、米国) にロードし、結合バッファー (5 mM イミダゾールを含む 50 mM NaH2PO4 および 300 mM NaCl、pH 8.0) で一定の​​流量で平衡化しました。 AKTAprime plus FPLC (GE Healthcare) を使用して 5 ml/分の流量。 5 ml HisTrap HP アフィニティーカラムを 40 ml の洗浄緩衝液 (10 mM イミダゾールを含む 50 mM NaH2PO4 および 300 mM NaCl、pH 8.0) で洗浄し、溶出緩衝液 (250 mM イミダゾールを含む 50 mM NaH2PO4 および 300 mM NaCl、 pH8.0）。 溶出ピークのある画分を収集し、Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit-3 kDa (MilliporeSigma) を使用して 7500 × g、40 分間、4 °C で遠心分離して濃縮し、バッファーを 100 mM Tris-HCl (20 mM NaCl、pH 7.8) バッファーを使用してイミダゾール濃度を下げます。 精製ペプチドサンプルの濃度は、標準タンパク質としてウシ血清アルブミンを使用し、Pierce BCA タンパク質アッセイキット (Invitrogen、Thermo Fisher Scientific) を使用して定量しました。

グラム陰性大腸菌 (American Type Culture Collection [ATCC] no. 11775)、グラム陽性黄色ブドウ球菌 (ATCC no. 12600)、およびグラム陽性酵母カンジダ アルビカンス (ATCC no. 10231) をルリア ベルターニ ブロスで培養しました。ブレインハートインフュージョンブロスとジャガイモデキストロースブロスをそれぞれ、37℃の振盪インキュベーター内で200rpmで一晩培養し、その後、培養した細菌を同じ培養ブロスで100倍に希釈した。 600 nm での光学密度 (OD600) が 0.5 に達した後、さまざまな濃度の組換えディフェンシン 1 および 2 のそれぞれ 10 μl アリコートを、96 ウェル プレート内の細菌培養液 90 μl とともに 37 °C の振盪インキュベーター内でインキュベートしました。一晩200rpm。 Tris-HCl緩衝液を陰性対照として使用した。 OD600 値は、VersaMax マイクロプレート リーダー (Molecular Devices、サンノゼ、カリフォルニア州、米国) を使用して測定しました。 最大阻害濃度の半分（IC50）は、GraphPad Prism 6（GraphPad Software、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して計算し、抗菌活性アッセイを 3 回繰り返して実施しました。

B. quintana JK31 野生型株は、もともと Jane Koehler 博士 (米国カリフォルニア州サンフランシスコのカリフォルニア大学) から入手したもので、ソウル大学 (LML08-1090) のバイオセーフティ レベル 2 施設で維持されていました。 B. quintana の凍結ストックを、キャンドル消火ジャー内のチョコレート寒天プレート上で 37 °C で 10 日間培養し、新しい寒天プレートに移してさらに 7 日間培養しました。 培養されたB.キンタナ細胞を回収し、1000×gで4分間遠心分離することにより、1mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすいだ。 さらに２回洗浄した後、ペレットを１００μｌのＰＢＳに再懸濁した。 100μlの細菌懸濁液の5μlのアリコートをPBSで連続希釈した。 次に、1000 倍に希釈した各細菌懸濁液 12 μl を、陽性対照として 100 μM ゲンタマイシン 12 μl、陰性対照として 100 mM トリス塩酸緩衝液、およびコロモジラミまたはディフェンシン由来の 100 μM 組換えディフェンシン 1 および 2 と完全に混合しました。 2 アタマジラミから。 合計 8 μl の混合物をチョコレート寒天プレートに 3 回滴下し、キャンドル消光ジャー内で 37 °C で 10 日間インキュベートした後、コロニー形成単位 (CFU) の数を計算しました。 コロニーインデックスは、陰性対照のCFU/μlでCFU/μlを割ることによって得られた。

コロモジラミ由来の組換えディフェンシン 1 および 2、およびアタマジラミ由来のディフェンシン 2 の溶血活性は、以前に記載されているようにヒト赤血球 (RBC) を使用して評価されました [16]。 RBCをPBSで960rpmで15分間3回洗浄し、その後2%の濃度でPBSに再懸濁した。 4つの濃度（10、20、50、および100μM）の組換えディフェンシン10μlのアリコートおよび5つの濃度（10、20、50、100、および200μM）の抗生物質をそれぞれ90μlのRBCとともに37℃で30分間インキュベートした。 °Cで960 rpmで15分間遠心分離しました。 上清の OD540 を VersaMax マイクロプレートリーダー (Molecular Devices) を使用して測定し、Tris-HCl 緩衝液と 0.1% Triton X-100 の相対溶血活性をそれぞれ 0% と 100% とみなしました。 溶血アッセイは 3 回の反復で実施され、プロトコールは治験審査委員会によって承認されました (治験審査委員会番号 E2211/001-003)。

各時点で、すべての実験データは 3 回収集されました。 Tukey の多重比較検定と対応のない t 検定による一元配置分散分析を使用して、P 値を解釈することで有意差を決定しました。 統計的有意性を P < 0.05 に設定し、GraphPad Prism 6.01 ソフトウェア (GraphPad Software) を使用して統計分析を実行しました。

体およびアタマジラミのディフェンシン 1 および 2 を、CLC Main Workbench 8 (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用してアラインメントしました (図 1)。 コロモジラミ ディフェンシン 1 (BLDef1) およびアタマジラミ ディフェンシン 1 (HLDef1) のオープン リーディング フレーム (ORF) 配列は、参照 BLDef1 配列 (アクセッション番号: XP_002428138.1) と完全に一致しました。 BLDef1 と HLDef1 は同一であり、20 アミノ酸のシグナルペプチド、46 アミノ酸のプロペプチド、および 43 アミノ酸の成熟ペプチド領域を含む 109 アミノ酸で構成されていました。 コロモジラミ ディフェンシン 2 (BLDef2) の ORF 配列は、参照配列 (アクセッション番号: XP_002432619.1) と完全に同一でしたが、アタマジラミ ディフェンシン 2 (HLDef2) 配列とはわずかに異なりました。 116 アミノ酸の HLDef2 配列と比較して、BLDef2 はシグナルペプチド領域の 1 つのシステイン残基とプロペプチド領域の 2 残基 (リジンとグルタミン酸) が欠失しているため、113 アミノ酸で構成されています。 さらに、BLDef2 と HLDef2 の間に 2 つのアミノ酸置換が見つかりました。1 つはプロペプチド領域 (BLDef2 ではアミノ酸 29 位のグルタミン、HLDef2 ではアミノ酸 30 位のアルギニン) で、もう 1 つは成熟ペプチド領域 (BLDef2 ではアミノ酸 29 位のアルギニン) でした。 BLDef2の場合はアミノ酸105位、HLDef2の場合はアミノ酸108位のアスパラギン酸）。 BLDef2の成熟ペプチドにおけるアスパラギン酸のチロシンによるラジカルアミノ酸置換は、BLDef2とHLDef2の間で異なる生物学的活性の可能性を示唆した。

コモジラミおよびアタマジラミ、ならびにネコノミおよびハミプテラン種を含む他の吸血昆虫のディフェンシン 1 およびディフェンシン 2 のアミノ酸配列のアラインメント。 矢印は成熟ペプチド領域の開始点を示し、アスタリスクはトリプシン様プロテアーゼのジペプチド切断部位を示し、白三角はBLDef2とHLDef2の間の異なるアミノ酸を示し、黒三角は保存された6つのシステイン残基を示します。 BLDef1 (XP_002428138.1) および BLDef2 (XP_002432619.1) の配列は、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) データベースから取得しました。 BL、コロモジラミ。 Def1、ディフェンシン1; Def2、ディフェンシン2; 参照、クテノセファリデス フェリス。 Cl、Cimex lectularius。 HL、アタマジラミ。 Rp、Rhodnius prolixus

トリプシン様プロテアーゼの保存されたジペプチド切断部位 (ヒトシラミと他の昆虫のディフェンシンにおける -RR- および -KR-) は、プロペプチド領域と成熟ペプチド領域の間に見つかり [17]、6 つの保存されたシステイン残基が調べたすべてのディフェンシンの成熟ペプチド領域 (図 1)。 ネコノミのディフェンシン 1 および 2 (-VT-) を除き、すべてのディフェンシンの成熟ペプチド領域の開始点にはアラニンおよびスレオニン残基 (-AT-) が含まれていました。 調査したすべてのディフェンシンの C 末端領域では、アルギニン - アルギニン (RR) またはアルギニン - リジン (RK) のいずれかの 2 つの塩基性残基が高度に保存されていることが示されました。 調査した昆虫種にわたるディフェンシン 1 および 2 の成熟ペプチドの配列類似性は、全長配列 (33.3 ～ 46% および 31.9 ～ 35.9%) と比較して比較的高かった (それぞれ 51.2 ～ 72.1% および 60.5 ～ 66.7%)。それぞれ）。

昆虫 33 種（翼翅目 2 種、双翅目 6 種、膜翅目 14 種、半翅目 5 種、鞘翅目 3 種、四翅目 1 種、厚翅目 1 種、直翅目 1 種）のディフェンシン 1 および 2 がコロモジラミのものと一致し、昆虫 46 種のディフェンシン 1 および 2 が一致した(フタラ翅目 2 匹、双翅目 5 匹、膜翅目 30 匹、半翅目 4 匹、鞘翅目 2 匹、鱗翅目 2 匹、四翅目 1 匹) をアタマジラミのものと並べました (追加ファイル 3: 図 S1)。 昆虫種のディフェンシンの成熟ペプチド領域は、5' 配列よりも高い配列類似性を示しました。 特に、6 個のシステイン残基がほとんどの成熟ペプチド領域で保存されており、6 個のシステイン残基がほとんどの昆虫ディフェンシンにおける代表的な構造モチーフの 1 つであることが実証されました。 系統樹では、シラミとノミの間に分類学的距離があるにもかかわらず、コロモジラミとアタマジラミのディフェンシン 1 および 2 は、ネコノミ Ctenocepharides felis (Siphonaptera) のディフェンシン 1 および 2 とクラスター化されていました (図 2)。

昆虫種からのディフェンシンの系統樹。 赤い点線のボックスはシラミディフェンシンのクレードを示します。 系統解析は、1000 回のブートストラップ複製による Jones-Taylor-Thornton (JTT) モデルに基づく最尤法を使用して実行されました。 ブートストラップ値のパーセンテージは、ツリーの各ノードに表示されます。 D、双翅目。 私、マダニ。 S、サイフォナプテラ。 P、プティラプテラ。 H、半翅目

BLDef1 および HLDef1 は、正に荷電したアミノ酸の数が最も少なく (14)、したがって比較的低い pI 値 (6.84) と pH 7 での正味電荷 (-0.2) を示しました。 BLDef1 および HLDef1 の疎水性 (40.37%) は、BLDef2 および HLDef2 の疎水性 (35.34%) よりも高かった (表 1)。 BLDef2 と HLDef2 の全体的な構造特性 (pI 値、正味電荷、疎水性など) は、正に荷電したアミノ酸の数 (それぞれ 18 および 19) を除いて同一でした。 BLDef1およびHLDef1はまた、プロペプチド除去ディフェンシンの中で正に荷電したアミノ酸の数が最も少ない(10)が、最も高いpI(9.61)および正味電荷(6.8)を示した。 プロペプチドを除去した BLDef2 と HLDef2 は、同じ数の正に荷電したアミノ酸 (11) と同じ割合の疎水性 (38.24%) を持っていましたが、pI (それぞれ 8.46 と 8.29) と正味電荷 (それぞれ 6.5 と 5.5) は異なり、プロペプチドを除去したBLDef1およびHLDef1よりも低い。 天然のディフェンシンと、体およびアタマジラミからプロペプチドを除去したディフェンシンは、同様の分子量を示しました（それぞれ、12.1 ～ 12.9 および 6.9 ～ 7.4 kDa）。

3D構造解析により、BLDef1とHLDef1は両方とも単一の同一のαヘリックス（His83-Lys93）で構成されているのに対し、BLDef2とHLDef2は1つのαヘリックス（Asn87-Ile96）と2つのβシート（β1：Gly104-Cys107）で構成されていることが明らかになりました。 ; β2: Cys112-Arg115) (図 3)。 ディフェンシン 2 の成熟ペプチドには、2 つの逆平行 β シート間のループに 1 つの異なるアミノ酸が含まれており、結合した画像の検査からわかるように、ループにわずかな歪みが生じていました (図 3)。 ただし、BLDef2 と HLDef2 の全体的な構造はほぼ同一でした。

シラミの体（上）とアタマジラミ（中央）のディフェンシン 1（左パネル）とディフェンシン 2（右パネル）の三次元タンパク質構造。 下の画像は結合した画像です。 コロモジラミ ディフェンシン 2 とアタマジラミ ディフェンシン 2 の間の異なるアミノ酸の側鎖が示されています。 N-ter、N-末端。 C-ter、C-末端

6 つの推定転写因子結合部位 (せむし (Hb) 様、変形 (Dfd) 様、偶数スキップ (Eve) 様、無尾 (Tll) 様、ペア (Prd) 様、および dpp に対する母親 (Mad) を含む) ) 様の部位は、BLDef1 および HLDef1 の推定上の調節領域 (転写開始部位から 800 bp 上流および 200 bp 下流) で一般的に同定され、さらに 1 つの Hb 様結合部位が HLDef1 の 796 ～ 802 bp 上流に存在します。 (図4)。 ディフェンシン 2 の場合、Hb 様、Dfd 様、Eve 様、Mad 様、および e2 因子 (E2F) 様の部位を含む 5 つの転写因子が、BLDef2 と HLDef1 の両方で一般的に見つかりました。 Hb 様部位は HLDef2 の 88 ～ 94 bp 上流に存在します (図 4)。

推定上の調節領域 (遺伝子転写開始部位から 800 bp 上流および 200 bp 下流) で観察される潜在的な転写因子結合モチーフ。 異なる色とパターンのバーは、さまざまな潜在的なモチーフを表します。 胴体シラミとアタマジラミの間の異なるモチーフはアスタリスクで示されています。 BLDef、コロモジラミディフェンシン。 HLDef、アタマジラミ防御シン。 DFD、変形。 イブもスキップしました。 Hb、せむし。 怒っているよ、民進党に反対する母親たち。 Prd、ペア。 T11、無尾翼

BLDef1転写物の3'UTRでは6つの推定miRNA結合部位が予測されたのに対し、HLDef1転写物では3つの推定miRNA結合部位が予測された(表2)。 ディフェンシン 2 転写物の 3'UTR では、BLDef2 では 5 つの推定 miRNA 結合部位が予測されましたが、HLDef2 では 4 つの推定 miRNA 結合部位が予測されました (表 2)。

アンピシリン、カナマイシン、ゲンタマイシンなどの陽性対照は、大腸菌と黄色ブドウ球菌の増殖を阻害しました。 しかし、C. albicans の増殖は、これらの抗生物質 (200 μM) および組換え BLDef1 および BLDef2 (100 μM) の最高濃度でも阻害されませんでした (表 3)。 アンピシリンは黄色ブドウ球菌を阻害し、最大半値阻害濃度（IC50）値は大腸菌に対するものより 44.5 倍低く（P = 0.0007）、一方、カナマイシンは大腸菌を阻害し、IC50 値は 8.5 倍低い（P = 0.002） ）、これら 2 つの抗生物質が細菌種に依存する高度に特異的な抗菌活性を持っていることを示しています。 ゲンタマイシンは、大腸菌および黄色ブドウ球菌に対して、他の 2 つの抗生物質およびコロモジラミおよびアタマジラミの組換えディフェンシンよりも低い IC50 値を示しました。 精製組換え BL/HLdef1 および BLDef2 は黄色ブドウ球菌の増殖のみを阻害し、同様の IC50 値 (それぞれ 33.2 ± 1.4 μM および 34.4 ± 0.8 μM; P = 0.2669) であり、その効力は、BL/HLdef1 および BLDef2 よりも約 20 倍および 48 分の 1 でした。それぞれアンピシリン (P < 0.0001) とゲンタマイシン (P < 0.0001) ですが、カナマイシンより 1.8 倍強力です (それぞれ P = 0.0093 および 0.0114)。 HLDef2 は、BL/HLDef1 (P = 0.004)、BLDef2 (P = 0.0031)、およびカナマイシン (P < 0.0001) よりも、黄色ブドウ球菌に対してそれぞれ 6.1 倍、6.4 倍、および 11.4 倍低い IC50 値を示しました。 これらの結果は、シラミディフェンシンがカナマイシンよりも有効なグラム陽性菌特異的抗菌活性を有し、またHLDef2がグラム陽性黄色ブドウ球菌に対してBLDef2よりも有意に高い抗菌活性を有することを示している。

ポジティブコントロールとして 50 μM ゲンタマイシンで処理すると、Tris-HCl 緩衝液で処理したネガティブコントロールと比較して、B. quintana コロニーの増殖が 98.4% 阻害されました (図 5)。 組換え HLDef2 は、B. quintana (97.2%) (P < 0.0001) に対して、BLDef2 (31.5%) (P = 0.0023) よりも有意に高い抗菌活性を示しました。 組換え BL/HLDef1 は、B. quintana に対して明らかな抗菌活性を示さなかった。

チョコレート寒天プレート上に滴下されたゲンタマイシン (P、ポジティブ コントロール)、トリス-HCl 緩衝液 (N、ネガティブ コントロール)、および BL/HLDef1、BLDef2、または HLDef2 処理バルトネラ キンタナ混合物の代表的な画像。 ゲンタマイシンとトリス塩酸緩衝液をそれぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールとして使用しました。 b 組換えシラミディフェンシンと B. quintana 混合物の阻害アッセイの結果。 コロニー指数は、B. quintana が Tris-HCl 緩衝液によって阻害されないという仮定の下、コロニー形成単位/マイクロリットル (CFU/μl) をネガティブコントロールの CFU/μl で割ったものから得られました。 結果は一元配置分散分析を使用して統計的に分析されました。星印は **P < 0.01 および ***P < 0.0001 で有意差を示します。 ns、大きな違いはありません。 BL/HLDef1、コロモジラミ/アタマジラミディフェンシン 1; BLDef2、コロモジラミディフェンシン 2。 HLDef2、アタマジラミディフェンシン 2

昆虫ディフェンシンは一般に、広範囲の病原体に対して活性です[18]。 組換えBL/HLDef1はグラム陽性黄色ブドウ球菌に対してのみ活性を示したが、組換えBL/HLDef2はグラム陽性黄色ブドウ球菌とグラム陰性黄色ブドウ球菌の両方に対して顕著に高い抗菌活性を示した。 ディフェンシンがグラム陰性菌に対して活性を示した同様の症例が、さまざまな節足動物で以前に報告されている[19、20、21、22、23、24]。 しかし、シラミのディフェンシンは、実質的に高い抗菌活性にもかかわらず、明らかな溶血活性を示さなかった。この観察は他のディフェンシンについても報告されている[17、25]。

昆虫ディフェンシンは通常、N 末端ループと α ヘリックス、その後にジスルフィド結合で接続された逆平行 β シート構造を持っています [26]。 BL/HLDef2 はこれらのユニークな構造を示しました。 しかし、BL/HLDef1 は、β シートを持たず、α ヘリックス フラグメントと 3 つのディフェンシン特異的システイン ペアのみを有するようでした。 さらに、シラミのディフェンシンは、正に帯電したペプチドと負に帯電した細菌膜成分（つまり、それぞれグラム陽性菌とグラム陰性菌の多糖類とリポ多糖類）の間の相互作用を通じて抗菌活性を発揮する他の昆虫ディフェンシンと同様に、高い pI 値を示しました。 27]。

ディフェンシンの 3 つのドメイン (シグナルペプチド、プロペプチド、および機能的成熟ペプチド) のうち、プロペプチドは一般に、その反対の正味電荷によってヒト好中球 α-ディフェンシン (HNP) の C 末端ドメインの抗菌活性を阻害すると考えられています [28] 。 カチオン性 HNP の活性化には、アニオン性プロペプチドのタンパク質分解による切除が必要です [29]。このことは、ディフェンシンのカチオン性成熟ペプチドとアニオン性プロペプチド間の阻害的な分子間相互作用には静電気力が重要である可能性があることを示しています [29]。 BL/HLDef1 と BL/HLDef2 の両方のプロペプチドと成熟ペプチドも反対の正味電荷を示しました。BL/HLDef1 のカチオン性成熟ペプチドの正味電荷は 7.8 であり、BLDef2 と HLDef2 の正味電荷はそれぞれ 7.8 と 6.8 でした。 対照的に、BL/HLDef1 のアニオン性プロペプチドの正味電荷は -8 であり、BL/HLDef2 の正味電荷は -2 および -1 でした。 これらの発見は、シラミ ディフェンシンのプロペプチドと成熟ペプチド間の潜在的な阻害性静電相互作用を示しているため、プロペプチドを使用せずにシラミ ディフェンシンの成熟ペプチド ドメインのみを発現させ、その生物学的特性を調査しました。

組換えHLDef2は、組換えBL/HLDef1またはBLDef2のいずれよりも、グラム陰性菌B.キンタナおよびグラム陽性黄色ブドウ球菌に対して有意に高い抗菌活性を示した。 ディフェンシン 2 の成熟ペプチド領域ではアミノ酸残基が 1 つだけ (BLDef2 ではチロシン、HLDef2 ではアスパラギン酸) だけがコロモジラミとアタマジラミの間で異なるため、このアミノ酸の違いが B. quintana と S. quintana に対する異なる抗菌活性の原因となっている可能性があります。 .黄色ブドウ球菌。 BLDef2 と HLDef2 の間の構造特性におけるアミノ酸置換によって引き起こされる唯一の大きく異なる要因は、pH 7 での正味電荷でした。正味電荷の増加 (BLDef2 では + 6.5 対 HLDef2 では + 5.5) は、アスパラギン酸のチロシンによる置換によって生じました。 BLDef2 では、昆虫ディフェンシンで一般に観察されるように、グラム陰性菌 B. quintana およびグラム陽性 S. aureus に対する抗菌活性の低下に寄与している可能性があり、正味電荷の低下がグラム陰性菌に対する高い抗菌活性と関連している [ 30]。 さらに、モデルとしての Nasonia vitripennis ディフェンシンの操作によって実証されているように [31]、昆虫ディフェンシンの β シート サブドメインは、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する広範な抗菌活性にとって重要な要素です。 したがって、βターンでのチロシン残基による置換によって引き起こされるβシートサブドメインの構造変化は、BLDef2の抗菌活性に影響を与える可能性があります。 総合すると、BLDef2 の β シート サブドメインにおける正味電荷の増加と構造変化が、特にコロモジラミの B. quintana に対する抗菌活性の低下の主な決定要因であると考えられ、これがベクター能力を増加させたと考えられます。

胴体シラミとアタマジラミの間のディフェンシン 1 と 2 の転写因子結合部位の唯一の違いは、HLDef1 と HLDef2 の調節領域に追加の Hb 様タンパク質結合部位が存在することでした。 せむしは、遺伝子調節タンパク質として機能する C2H2 ジンクフィンガータンパク質ファミリーに属しています [32]。 Hb 様タンパク質が体およびアタマジラミのディフェンシン遺伝子の転写を活性化するか抑制するかは不明です。 それにもかかわらず、シラミにおける Hb 様タンパク質の転写活性化の役割を仮定すると、HLDef1 または HLDef2 のいずれかに Hb 様タンパク質の追加の結合部位が存在すると、アタマジラミ [4] およびシラミの基礎転写レベルが高くなる可能性があります。 B. quintana による経口攻撃後のアタマジラミの消化管組織におけるディフェンシン 1 の誘導発現 [5]。 miRNA は、mRNA との塩基対形成を介して遺伝子発現を制御する、21 ～ 24 ヌクレオチドの長さの短い内因性非コード RNA の一種です [33]。 5'末端に2〜8ヌクレオチドを持つmiRNAの「シード配列」は、mRNAの3'UTRの相補的一致部位に結合し、その結果、標的遺伝子の翻訳および発現またはmRNA分解が阻害される[34]。 BLDef1 転写物の 3'UTR では、HLDef1 転写物 (3) と比較して、推定 miRNA 結合部位 (6) の数の増加が予測されました。 同様に、HLDef2 転写物 (4) と比較して、BLDef2 の 3'UTR では推定 miRNA 結合部位 (5) の数の増加が予測されました。 これらの発見は、アタマジラミでは BLDef1 と BLDef2 の両方の発現が HLDef1 と HLDef2 の発現よりも下方制御される可能性が高いことを示唆しています。 したがって、コロモジラミにおける BLDef1 および BLDef2 の発現の相対的な低下は、媒介能力の向上に寄与していると考えられます [5]。

ヒトの病気を媒介するベクターの免疫系を理解することは、ベクターの能力を主に決定するのは免疫系であるため、非常に重要です。 しかし、コロモジラミにおけるB. quintana、R. prowazekii、B. recurrentisなどの細菌性病原体に対する免疫防御カスケードは、依然としてほとんど知られていない。 それにもかかわらず、我々は、(i) コロモジラミは機能的に変化したディフェンシン 2 を持っており、この研究で使用したモデル病原体である B. quintana に対する効果が著しく低いこと、および (ii) ディフェンシン 1 とディフェンシン 2 の両方の発現が低下していることを解明しました。おそらく、転写因子結合と miRNA 結合の調節配列の違いにより下方制御されていると考えられます。 したがって、コロモジラミの媒介能力が比較的高いのは、主に、病原性細菌に対するディフェンシン 2 の抗菌活性の低下と、BLDef1 と BLDef2 の両方の量が少ないためであると考えられます。

ディフェンシン 1 とディフェンシン 2 は、人体とアタマジラミに存在する唯一の抗菌ペプチドであり、構造と抗菌活性に違いがあります。 コロモジラミにおけるディフェンシン 2 の抗菌活性の大幅な低下と、ディフェンシン発現および転写活性の確率の低下は、B. quintana の増殖および生存率に対する免疫反応の緩和に寄与している可能性が高く、その結果、アタマジラミと比較してコロモジラミの媒介能力が高くなります。 これらのデータは、ディフェンシン 1 および 2 によって媒介されるコロモジラミとアタマジラミの間の異なるベクター能力の深い理解を促進します。

適用できない。

抗菌ペプチド

コロモジラミディフェンシン

コロニー形成ユニット

変形した

E2係数

スキップさえした

せむし

アタマジラミディフェンシン

最大半値阻害濃度

母親たちは民進党に反対する

マイクロRNA

リン酸緩衝生理食塩水

ペアリング済み

赤血球

無尾翼

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B. quintana JK31株についてはJane Koehler教授（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）、洞察力に富んだ議論についてはJinki Yeom教授（ソウル国立大学医科大学）に感謝いたします。

この研究はソウル大学病院から一部支援を受けました。 DEL は Brain Korea 21 Four プログラムによって支援されました。

ソウル国立大学農学生命科学研究所、ソウル、08826、韓国

キョンジェ アンドリュー・ユン & シ・ヒョク・リー

ソウル国立大学農業バイオテクノロジー学部、ソウル、08826、韓国

イ・ドウン＆イ・シヒョク

ソウル国立大学医学部熱帯医学および寄生虫学教室、ソウル、03080、韓国

キム・ユヒョン

ソウル国立大学医学部風土病研究所、ソウル、03080、韓国

キム・ユヒョン

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KAYは実験を行い、原稿を書きました。 DELは実験を行った。 SHL と JHK が研究を設計しました。 JHK は調査作業を監督し、原稿を執筆しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

キム・ジュヒョンさんへの手紙。

ヒトの血液を使用したコロモジラミおよびアタマジラミの in vitro 飼育システム、およびコロモジラミおよびアタマジラミからのディフェンシンの溶血アッセイは、ソウル国立大学治験審査委員会によって審査され、承認されました (治験審査委員会番号 E2211/001-003)。

適用できない。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

コロモジラミおよびアタマジラミのディフェンシン 1 および 2 の in vitro 発現に使用されるプライマー。

コロモジラミおよびアタマジラミ由来の組換えディフェンシンおよび抗生物質の溶血活性。

コロモジラミ、アタマジラミおよび他の昆虫種のディフェンシン 1 および 2 のアミノ酸配列アラインメント。 6 つの保存されたシステイン残基は赤いボックスでマークされています。

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転載と許可

Yoon, KA、Lee, D.、Lee, S. 他 Bartonella quintana に対するコロモジラミとアタマジラミのベクター能力の違いにおけるディフェンシンの潜在的な役割の探索。 寄生虫ベクター 16、183 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s13071-023-05802-4

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受信日: 2023 年 2 月 21 日

受理日: 2023 年 5 月 8 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05802-4

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